【資料圖】
CRISPR技術(shù)改變了我們操縱基因組進行研究和基因治療的能力，使用帶有同源臂的外源供體作為模板依賴同源介導(dǎo)修復(fù)（HDR）途徑來精確敲入基因。然而，對于基因大小的DNA供體模板，HDR途徑較為低效。目前，可采用在ssDNA或dsDNA供體末端引入化學(xué)修飾以增強供體穩(wěn)定性，供體共價連接到CRISPR系統(tǒng)上提高切割位點局部濃度等方法提高基因敲入效率。然而，這些方法具有操作困難、成本高等問題。亟需進一步優(yōu)化基因敲入的供體，以促進CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因大小的敲入在生命科學(xué)和臨床治療中的應(yīng)用。
鑒于此，梁好均課題組深入調(diào)研ssDNA和dsDNA作為供體的敲入機理，結(jié)合課題組在核酸化學(xué)領(lǐng)域的經(jīng)驗，在單個供體中整合ssDNA和dsDNA的獨特優(yōu)勢，設(shè)計并提出了一種具有3′懸突的dsDNA結(jié)構(gòu)（odsDNA），并將其作為供體實現(xiàn)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的大片段基因敲入（LOCK）。
本工作是梁好均課題組繼dsDNA供體5′末端化學(xué)修飾提高基因敲入效率和RNA介導(dǎo)的CRISPR-dCas9轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)之后，在基因編輯方向的又一重大突破。該研究提出了一種經(jīng)濟普適的方法來制備任意3′懸突長度的odsDNA供體，利用鏈中帶有連續(xù)五個硫代磷酸酯（phosphorothioate）修飾的引物通過PCR擴增目的基因序列，再通過Lambda核酸外切酶消化處理，得到具有3′懸突的odsDNA。研究通過比較基因大?。?.1kb和2.5kb）的DNA供體的敲入效率，發(fā)現(xiàn)odsDNA顯著提高了靶向精確敲入效率，且與通用的dsDNA供體相比最高可提高4.3倍，同時在許多哺乳動物細(xì)胞跨多個基因組位點中保持了較低的插入缺失率和脫靶事件。當(dāng)利用3′單鏈懸臂與偶聯(lián)技術(shù)結(jié)合時，使用odsDNA供體的敲入效率比dsDNA供體提高5.2倍。該LOCK策略在基因敲入中具有優(yōu)勢，有望在未來取代ssDNA或dsDNA供體，實現(xiàn)其他策略無法完成的大片段基因敲入。
研究工作得到科學(xué)技術(shù)部和國家自然科學(xué)基金的支持。
論文鏈接
圖1.（A）ssDNA供體基因敲入的機理，（B）dsDNA供體基因敲入的機理，（C）odsDNA的結(jié)構(gòu)，（D）odsDNA供體基因敲入的機理
圖2.odsDNA的合成示意圖及用于基因敲入的三種方法
